引物合成的原理-常见问题解答-通用生物
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    引物优发国际手机版的原理

           目前引物优发国际手机版基本采用固相亚磷酰胺三酯法。基于该方法的DNA优发国际手机版仪有多种,主要差别在于优发国际手机版产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。通用生物公司采用新一代高通量自动基因优发国际手机版仪技术,充分保证了实验室相关领域的研究及生物产业应用的不同需求。

           固相亚磷酰胺三酯法优发国际手机版DNA片段,具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的优发国际手机版的,优发国际手机版方向是由3’端开始,相邻的核苷酸通过3’→5’磷酸二酯键连接。具体的反应步骤如下:

           第一步,脱保护基(Deblocking),将被固相载体(CPG,树脂等)上保护的活性基团与三氯乙酸反应,脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基;

           第二步,活化(Activation),将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入优发国际手机版柱,形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化,但5'-端仍受DMT保护),此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应;

           第三步,连接(Coupling),亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时,将与其5'-羟基发生亲合反应,缩合并脱去四唑,此时优发国际手机版的寡核苷酸链向前延长一个碱基;

           第四步,带帽(Capping),缩合反应后,为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸,常通过乙酰化来封闭此端羟基,一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的;

           第五步,氧化(Oxidation),缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接,而亚磷酯键不稳定,易被酸、碱水解,此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯,得到稳定的寡核苷酸。

           经过以上五个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求优发国际手机版的碱基被接上去。优发国际手机版过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定优发国际手机版效率。


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